TEWICOS

In den obersten Schichten der Haut, die durch UV-Strahlung besonders belastetet werden, kann oxidativer Stress krankhafte Veränderungen verursachen – von Entzündungsreaktionen bis hin zu Hauttumoren. Eine Schädigung des Kollagens durch reaktive Sauerstoffspezies bei gleichzeitig verminderter Kollagenneubildung führt außerdem zu zunehmender Faltenbildung und Hautalterung. Durch topische Applikation von Antioxidantien kann dem in gewissem Maße vorgebeugt und entgegengewirkt werden. Innovative Phytoextrakte, die reich an Antioxidantien sind, liegen daher im Trend als Rohstoffe für „Cosmeceuticals“ – also für Kosmetikprodukte mit wissenschaftlich nachweisbarer Wirkung.
Mikroalgen sind als natürliche Quelle für diese Wirkstoffklasse noch kaum erschlossen, obwohl Antioxidantien wie das Sekundärcarotinoid Astaxanthin aus der Grünalge Haematococcus pluvialis zu den hochwertigsten Stoffen zählen, die aktuell biotechnologisch aus Mikroalgen gewonnen werden. Neben Carotinoiden bilden Mikroalgen weitere antioxidativ wirksame Moleküle wie Polyphenole, Vitamine, Sterole, sulfatierte Kohlenhydrate sowie spezielle Aminosäuren und Peptide. Extrakte aus Mikroalgen werden in Kosmetika außerdem aufgrund ihres Nähr- und Mineralstoffreichtums und wegen feuchtigkeitsbindender, entzündungshemmender oder die Wundheilung fördernder Wirkungen angewandt.
Die Herausforderung besteht darin, 1) hinreichend hohe Wirkstoffgehalte zu erzielen und 2) den gesamten Produktionsprozess so effizient zu gestalten, dass die Mikroalgenextrakte im Vergleich zu am Markt etablierten Phytoextrakten konkurrenzfähig werden. Eine Option zur Steigerung der Wirtschaftlichkeit und Ressourceneffizienz ist die möglichst umfassende Ausnutzung der erzeugten Biomasse durch Gewinnung mehrerer Koppelprodukte, z.B. durch Kaskadenextraktionen und Verwertung der Extraktionsrückstände (Bioraffinerie-Konzept).

Ziel des Verbundvorhabens war die Nutzbarmachung der Grünalge Tetradesmus wisconsinensis zur industriellen Produktion von Extrakten für die kosmetische Anwendung. Diese Mikroalgenart war im Rahmen früherer Forschungsarbeiten an der Hochschule Anhalt selektiert worden, da sie im Gegensatz zu H. pluvialis neben Astaxanthin anteilig hohe Mengen des ebenfalls antioxidativ wirkenden Sekun-därcarotinoids Canthaxanthin bildet.
Folgende Teilaufgaben waren zu lösen:

• Optimierung der zweistufigen Kultivierung von T. wisconsinensis hinsichtlich einer hohen Canthaxanthin-Produktivität
• Hochskalierung des Kultivierungsverfahrens bis in den industriellen Maßstab
• Entwicklung von Aufarbeitungsverfahren zur gekoppelten Gewinnung mehrerer unterschiedlich polarer Extrakte aus den Biomassen der zweistufigen Kultivierung
• Biochemische Charakterisierung der Biomassen, Extrakte und Extraktionsrückstände sowie funkti-onelle Charakterisierung der Extrakte in vitro und in vivo
• Applikationsentwicklung Kosmetika
• Optimierung des Energie- und Ressourcenverbrauchs für ein nachhaltiges Verfahren

Optimierung von Biomassebildung und Produktakkumulation

• Für die Biomassebildung in der Wachstumsphase sind das Nährmedium 3N-BBM sowie hohe Lichtstärken mit L/D 14:10 bei einer Temperatur von 25°C am besten geeignet. Eine kurze Kulturdauer unter nährstoffsuffizienten Bedingungen ist von Vorteil, da eine hohe Vitalität der Inokulumkultur für die folgende Produktbildung essentiell ist.
• Für die Biomasse- und Produktbildung in der Stressphase wurde das Mangelmedium 3N-BBM-N/P mit Zusatz von NaCl als optimal eingeschätzt. Ein positiver Einfluss auf die Sekundärcarotinoidproduktion wurde außerdem durch eine Steigerung der Initialbiomasse auf 1,0 – 1,5 g L-1 erzielt. Die Kulturdauer in der Stressphase sollte so gewählt werden, dass der Aufbau der Sekundärcarotinoide und der Abbau der Chlorophylle möglichst vollständig ablaufen kann.
• Der Effekt der Lichtstärke in der Stressphase scheint ambivalent zu sein. Für Stresskulturen mit 0,5 g L-1 Initialbiomasse in Mangelmedien ohne NaCl-Zusatz war Starklicht von 455 μE m-2 s-1 in allen Fällen nachteilig für die Biomasseentwicklung, so dass – trotz des bei hoher Lichtstärke um 27% gesteigerten Carotinoidgehaltes in der Biomasse – die maximale Carotinoidproduktivität bei mittlerer Lichtintensität erzielt wurde. Bei Stresskultivierung mit 1,2 g L-1 Initialbiomasse in 3N-BBM-N/P+NaCl wurde jedoch mit allseitigem Starklicht von 455 μE m-2 s-1 mit L/D 14:10 eine Biomasseproduktivität von 0,27 g L-1 d-1 und eine Biomassekonzentration von 4,1 g L-1 an Tag 10 und damit der höchste Wert insgesamt erreicht. Anscheinend ist bei der zum Zeitpunkt der Inokulation dichteren Kultur die Durchdringung durch das Starklicht in der Anfangsphase niedriger, so dass der Einfluss auf die Algenzellen weniger stark ist als bei geringerer Zelldichte. Nach Adaption der Kultur an die Stressbedingungen ist dann eine stärkere Durchdringung als bei Beleuchtung mit mittlerer Lichtstärke förderlich für das Wachstum und die Produktbildung.
• Eine Dauerbelichtung L/D 24:0 während der Stressphase wirkt sich bei Beleuchtung mit Starklicht negativ auf die Carotinoidproduktivität aus, zeigt aber bei Beleuchtung mit Schwachlicht als zusätz-licher Stressor eine positive Wirkung.

Kultivierung im industriellen Maßstab

• Das Verfahren zur biotechnologischen Produktion von Sekundärcarotinoiden mit T. wisconsinensis konnte bis in den Industriemaßstab hochskaliert werden. Ohne Einsatz künstlicher Beleuchtung waren die Biomassegehalte und -produktivitäten in einem 12500 L fassenden Röhrenreaktor sowohl in der Wachstums- als auch in der Stressphase wie erwartet geringer als bei der Kultivierung im Labormaßstab. Der finale Sekundärcarotinoidgehalt lag nach 14-tägiger Stresskultivierung bei 7,56 mg L-1 Kultur. Der Anteil der Sekundärcarotinoide an der Biotrockenmasse war mit etwa 0,5% ähnlich hoch, wie bei der Kultivierung in 2L-BS-PBR.

Zellaufschluss

• Durch Nassvermahlung der Mikroalgen mittels RWKM wurde ein vollständiger Zellaufschluss erzielt.
• Für unter Mangelbedingungen gewachsene T. wisconsinensis Kulturen (orange Phase) waren längere Mahlzeiten erforderlich als für physiologische Kulturen (grüne Phase).

Gewinnung von hydrophilen und lipophilen Extrakten

• Die Kaskadenextraktion aus grüner Biomasse mit Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität erhöhte die Gesamtausbeute an Extrakt. Bei der Verarbeitung der Biomasse konnte auf die Trocknung verzichtet werden. Der Zellaufschluss steigerte die Ausbeute an Extrakttrockensubstanz, Chlorophyllen und Antioxidantien. Durch Kaskadenextraktion Wasser-Ethanol ließen sich zwei hinsichtlich Trockensubstanz- und Antioxidantien-Gehalten ähnlich reichhaltige Koppelextrakte erzeugen.
• Zur Gewinnung der thermolabilen Sekundärcarotinoide aus oranger Biomasse war eine primäre Lösungsmittelextraktion zielführend. Der Sekundärcarotinoid-reiche Lipidextrakt ließ sich aus lyophilisierter Biomasse mit Ethanol bei Normaldruck selbst ohne vorherigen Zellaufschluss vollständig gewinnen. Alternativ war auch die SFE mit CO2 geeignet. Die Trocknung der Biomasse war in diesem Fall obligat und bei Extraktion mit reinem CO2 war auch der vorherige mechanische Zellaufschluss erforderlich. Der Einsatz von 10% Ethanol als Co-Solvent der SFE ermöglichte die Extraktion der Sekundärcarotinoide aus ungemahlener Biomasse mit geringem Verlust und höherer Selektivität.

Analytische, bioanalytische und funktionelle Charakterisierung

• Die biochemische Zusammensetzung der T. wisconsinensis Biomassen wurde hinsichtlich der Stoffklassenanteile analysiert. Während die Biomasse der Wachstumsphase mit 41% zum größten Teil aus Proteinen aufgebaut war, bestand die Biomasse der Akkumulationsphase zu etwa 50% aus Lipiden, einem fast ebenso hohem Anteil an Kohlenhydraten und nur zu 6,5% aus Proteinen. Auch die Fettsäure-Zusammensetzung änderte sich. In oranger Biomasse war der Gehalt der ungesättigten Fettsäuren C18:1 und C18:2 deutlich höher als in grüner Biomasse.
• Der Anteil von Canthaxanthin an den Carotinoiden in oranger Biomasse lag bei 20 – 30%, hinzu kamen 10% freies Adonixanthin und Astaxanthin sowie 50% veresterte Sekundärcarotinoide und etwa 10% Primärcarotinoide. Als Maximalwert wurde ein Canthaxanthin-Gehalt von 2,33 mg g-1 BTS und ein Carotinoid-Gehalt von 8,05 mg g-1 BTS erzielt.
• Um neben den Sekundärcarotinoiden weitere Antioxidantien in den Extrakten quantifizieren zu können, wurden DPPH-Assay (Radikalbindekapazität) und Folin-Ciocalteu-Assay (Totalphenolgehalt) angewandt. Die wässrigen Extrakte wiesen tendenziell eine höhere DPPH-Aktivität, die ethanolischen Extrakte eine höhere FC-Aktivität auf. In den T. wisconsinensis Extrakten wurden mit dem DPPH-Assay Aktivitäten von bis zu 1210 μM Trolox-Äquivalent gemessen und mit dem FC-Assay Werte von bis zu 4343 μM Gallussäure-Äquivalent. Die DPPH-Aktivität der wässrigen und ethanolischen Extrakte aus grüner Biomasse stieg mit der Extraktionstemperatur an, während die FC-Aktivität ethanolischer Extrakte bei Temperaturen über 60°C sank. Die Antioxidantien in ethanolischen Sekundärcarotinoidextrakten aus oranger Biomasse waren temperaturempfindlich.
• Erste Analysen zur Wirkung ausgewählter T. wisconsinensis Extrakte auf humane Keratinozyten ergaben für einen Sekundärcarotinoid-haltigen Ethanolextrakt aus oranger Biomasse eine schwach messbare intrazelluläre antioxidative Aktivität im DCFH-Assay. Ein Ethanolextrakt aus grüner Biomasse förderte die Zellproliferation, war jedoch zugleich prooxidant im DCFH-Assay. Hier wird derzeit eine Fraktionierung des Extraktes durchgeführt. Auch der Einfluss der Verarbeitungsform auf die intrazelluläre Wirkung ist noch zu klären, z.B. Mahlen der Biomasse; CO2-Extrakt vs. Soxhlet-Extrakt.

Extraktstabilisierung

• Die ethanolischen Trockenextrakte aus oranger Biomasse T. wisconsinensis können für 6 Monate bei 4°C gelagert werden. Für die Sekundärcarotinoide wurden unter diesen Bedingungen Abbauraten < 5% ermittelt. Die DPPH-aktiven Substanzen waren wenig stabil, sind aber in den orangen Lipoextrakten generell gering konzentriert. Die ethanolischen Trockenextrakte aus grüner Biomasse sollten über längere Zeiträume bei -20°C aufbewahrt werden, bei Lagerung bei 4°C nahmen die Pigmentgehalte in 6 Monaten um 6 – 12% ab. Die DPPH-Aktivität war relativ stabil.
• Der Zusatz von Ascorbylpalmitat und α-Tocopherol verlangsamte den Abbau der Sekundärcarotinoide und der DPPH-aktiven Substanzen in den Extrakten der orangen Biomasse, wirkte sich aber nicht stabilisierend auf Primärcarotinoide und Chlorophylle in den Extrakten grüner Biomasse aus.

Applikationsentwicklung

• Der Canthaxanthinreiche Lipidextrakt aus T. wisconsinensis wurde im Rahmen einer wissenschaftlich begleiteten in vivo Studie mit 33 Probandinnen hinsichtlich pflegender, faltenglättender und feuchtigkeitsspendender Wirksamkeit untersucht. Durch die Konzeption als Placebo-Studie wurde sichergestellt, dass selektiv der Effekt des in geringer Konzentration in eine Hydrogelformulierung eingearbeiteten Algenextraktes erfasst wurde. Nach nur 4-wöchiger Anwendung des Algen-Hydrogeles im Gesicht wurde im Vergleich zum Placebo eine deutliche Verbesserung der Hautfeuchtigkeit und eine geringe Anti-Faltenwirkung gemessen. Die dermatologische Untersuchung vor und während der Studie bestätigte zudem die sehr gute Hautverträglichkeit des Produktes. Bei der Evaluation mit Probandenfragebogen wurde das Algen-Hydrogel insgesamt überwiegend positiv bewertet.

Technische und energetische Kopplung

• Durch das Bewusstmachen des Energie- und Ressourcenbedarfes während aller Stadien der Verfahrensentwicklung anhand erfasster Verbrauchsdaten und durch die daraus resultierenden Anpassungen bei der Verfahrensgestaltung konnte die Energie- und Ressourceneffizienz erhöht werden.

Aktuell sind keine öffentlichen Publikationen verfügbar.